雙抗夾心ELISA檢測(cè)食品中大腸桿菌O157-H7方法研究
ELISA *包被濃度確定
包被是 ELISA 實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵的一步，如果濃度過低， 包被液中的蛋白質(zhì)不能*覆蓋固相載體表面，隨后加入的特異性抗體和酶標(biāo)二抗就有可能直接被吸附到固相載體上，zui后產(chǎn)生非特異性顯色而使檢測(cè)結(jié)果偏高；濃 度過高，蛋白質(zhì)分子的相互作用影響聚苯乙烯與蛋白質(zhì) 之間的吸附，以至在隨后的抗原抗體反應(yīng)、洗滌等步 驟中，部分抗原或與抗體結(jié)合釋放到洗滌液中被棄去， 或直接釋放到洗滌液中造成抗原的浪費(fèi)，因此，在 ELISA 測(cè)定中首先要測(cè)定合適的包被濃度。
雙抗夾心 ELISA 的反應(yīng)時(shí)間
在保證 ELISA 有效檢測(cè)病原菌的前提下，快速、方 便也是雙抗夾心 ELISA 的必要條件。雙抗夾心 ELISA 從 加入待測(cè)抗原到得出結(jié)果，檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7 共需 要 5h 左右，而間接 ELISA 則需要 7h(包被 37℃，2h)或 者 17h(包被 4℃guo夜)。本論文篩選出的雙抗夾心 ELISA 檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7 省去封閉這一步驟。在間接 ELISA 測(cè)定抗原中，封閉一般是*的，因?yàn)榘?被不同濃度抗原不一定可以*覆蓋固相載體表面，如 果不封閉，很可能使隨后加入的特異性抗體和酶標(biāo)二抗 直接被吸附到固相載體上，產(chǎn)生非特異性顯色而使檢測(cè) 結(jié)果偏高。但是對(duì)于雙抗體夾心 ELISA 來(lái)說(shuō)，在包被 捕獲抗體時(shí)已經(jīng)使固相載體飽和，已經(jīng)沒有多余的吸附 力來(lái)吸附隨后加入的特異性抗體和酶標(biāo)二抗，這都說(shuō)明 了雙抗夾心 ELISA 有不需要封閉的可能，通過正交試驗(yàn) 結(jié)果也證明不封閉可以達(dá)到理想實(shí)驗(yàn)效果，而且還縮短 了整個(gè)檢測(cè)流程和時(shí)間，說(shuō)明只要酶標(biāo)記物是高活性的 并且操作時(shí)洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意結(jié)果。雙抗夾心 ELISA 檢測(cè)法的特異性和靈敏性 抗原抗體的結(jié)合實(shí)際上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間，由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空 間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特 異性。但這種特異性并不是的，假使兩種化合物 有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可能出現(xiàn)交叉 反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌 O157:H7 及其他菌株共 10 株作 為抗原用來(lái)檢測(cè)本方法的特異性，結(jié)果顯示大腸桿菌 O157:H7 呈明顯陽(yáng)性反應(yīng)，其余各菌株均呈陰性反應(yīng)， 說(shuō)明本方法對(duì)大腸桿菌 O157:H7 具有明顯的檢測(cè)特異 性，而對(duì)所測(cè)定的其它菌株無(wú)交叉反應(yīng)。
本論文所建立的雙抗夾心 ELISA 方法對(duì)純培養(yǎng)的 大腸桿菌 O157:H7 檢出限均105CFU/ml，Kerr 和 Chart 等[6]建立的雙抗夾心 ELISA 檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7 的檢測(cè)限為 10 5 CFU/ml ，趙志晶和劉秀梅[7] 建立的雙抗夾心ELISA 檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7 的檢測(cè)限為 104CFU/ml，兩 者均用單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，而本方法使用 IgY 抗 體與兔多克隆抗體，制備相對(duì)比單克隆抗體簡(jiǎn)單，對(duì)試 劑、成本要求也相對(duì)降低，其效果基本達(dá)到檢測(cè)要求。
結(jié) 論
本研究通過水稀釋法及硫酸銨鹽析法純化抗大腸桿 菌 O157:H7 IgY，10mg/ml 純化 IgY 的效價(jià)為 1:320。以 大腸桿菌 O157:H7 免疫新西蘭大耳白兔，獲得了抗大腸 桿菌 O157:H7 的多克隆抗體，效價(jià)可達(dá) 1:25600。確定 雙抗夾心 ELISA 檢測(cè)條件的正交實(shí)驗(yàn)分析表明，捕獲抗 體于 37℃包被 2h、不封閉、與抗原于 37℃結(jié)合 2h、檢 測(cè)抗體濃度為 0.25mg/ml、與抗原于 37℃結(jié)合 1h 為* 條件。該方法穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，對(duì)純培養(yǎng)菌液檢 出限為 105CFU/ml，具有良好的敏感性及特異性，為快 速檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7 奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。染菌食品在 EC 增菌液中培養(yǎng)后進(jìn)行雙抗夾心 ELISA 檢測(cè)，含有 0.1～
1CFU/ml 大腸桿菌 O157:H7 的樣品在增菌 12h 后可以檢出 陽(yáng)性反應(yīng)，含有 1～10CFU/ml 大腸桿菌 O157:H7 的樣品 在增菌 8h 后可以檢出陽(yáng)性反應(yīng)，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于檢 測(cè)結(jié)果無(wú)意義。
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