ELISA法檢測HIV抗體的影響因素

酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）是一種常用的固相免疫測定方法，被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的測定?！度珖滩z測技術(shù)規(guī)范》（2009年修訂版）中要求：各篩查實驗室在進行抗體檢測時，先用第一種篩查試劑（高敏感性ELISA）檢測，出現(xiàn)陰性反應(yīng)報告“HIV抗體陰性"，出現(xiàn)陽性反應(yīng)時不可直接報告陽性結(jié)果，則用另一種不同原理或不同廠家的篩查試劑（高特異性ELISA）復(fù)檢，所以ELISA法目前普遍用于艾滋病病毒抗體（HIV抗體）初篩實驗室用于HIV抗體的測定，但ELISA測定中影響因素較多，而且對檢驗人員的操作技術(shù)要求也較高，因此，為了得到準(zhǔn)確可靠的檢驗結(jié)果，必須對ELISA法中的諸多影響因素采取相應(yīng)的控制措施。目前，HIV抗體初篩實驗室常用的是血液標(biāo)本。血液標(biāo)本常見的干擾因素有內(nèi)源性干擾和外源性干擾。

內(nèi)源性干擾因素：包括類風(fēng)濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體等，這些因素的存在，常使結(jié)果出現(xiàn)假陰性或假陽性等偏差，針對這些問題，解決辦法：（1）用0.01mol/L，pH7.2PBS（磷酸鹽緩沖液）將標(biāo)本做1:1稀釋；（2）溫度56℃、時間30min將血清滅活。

外源性干擾因素：外源性干擾物質(zhì)常常是由于血液標(biāo)本在采集、保存、運送等過程中操作不當(dāng)所造成，比如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時間久、標(biāo)本凝集不全或加入抗凝血物質(zhì)等。針對這些問題，解決辦法：（1）盡量避免樣品溶血；（2）標(biāo)本采集后應(yīng)室溫下自然防置1h～2h，待血液凝固、xue塊收縮后再用1500~3000r/min離心15min，吸出血清；（3）血清標(biāo)本應(yīng)立即進行測定，對于不能立即測定的標(biāo)本，需2℃~8℃保存，超過一周以上測定的標(biāo)本應(yīng)-20℃以下保存；（4）標(biāo)本中加入抗凝物質(zhì)時，盡量避免使用酶抑制劑，以免造成對ELISA中酶活性的影響。

試劑的選擇：應(yīng)使用經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準(zhǔn)的、敏感性高、特異性好的試劑；更換試劑批號時，應(yīng)進行平行試驗；試劑盒嚴(yán)格控制在有效期內(nèi)使用。

試劑的預(yù)處理：在ELISA法測定時試劑的預(yù)處理非常關(guān)鍵，也是較容易忽略的一個步驟，具體的做法：每次試驗前，將試劑盒從冰箱內(nèi)取出，室溫下放置20min～30min，使試劑盒在使用前與室溫基本平衡一致，以免影響到抗原抗體的結(jié)合與反應(yīng)的速度。

溫度：是ELISA法測定中最為重要的一個問題，它直接決定著試驗的成敗，所以在HIV抗體測定中一定要注意溫度的控制。ELISA以酶催化底物顯色來判斷結(jié)果，而抗原與抗體的合和酶催化底物的效率均與溫度密切相關(guān)，溫度高，顯色深，S/CO值高，反之，顯色淺，S/CO值低，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在日常實際操作時，常忽略從室溫平衡的溫度逐步上升到37℃需要17min。為保證37℃下有足夠的反應(yīng)時間，各實驗室可自行確定本實驗室不同季節(jié)微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長時間孔內(nèi)溫度才能達到37℃，從而適當(dāng)延長反應(yīng)板在恒溫箱中的放置時間。具體的做法是，用一小溫度計單獨放置在非檢測樣品的空白板孔溶液中測量觀察。

加樣操作：加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不要觸及孔壁，加完后輕輕晃動混勻，并在酶標(biāo)板上加覆膜。

洗滌與浸泡：反應(yīng)板的洗滌次數(shù)及浸泡時間的長短，也直接影響著檢測結(jié)果，一般洗滌5～6次，浸泡時間每次為50s，洗滌次數(shù)過多或過少、浸泡時間過長或過短容易造成假陰性或假陽性。

酶標(biāo)儀讀板：每次測定標(biāo)本吸光度前，要將酶標(biāo)儀開機預(yù)熱不低于20min，而且要在15min

內(nèi)判讀完畢。

室內(nèi)質(zhì)控品：是非試劑盒組份的外部質(zhì)控品，用來判斷本次實驗樣品檢測的有效性?？梢允巧唐坊?qū)嶒炇易孕兄苽?。以該試劑盒臨界值（Cut-off）的2-3倍為宜。每次試驗必須包含室內(nèi)質(zhì)控品，其結(jié)果無效，必須重新實驗。

對于我們每一位檢驗人員來說，不管是檢驗標(biāo)本，還是檢驗試劑、試驗溫度、儀器設(shè)備等等，只要把握好每個環(huán)節(jié)，就可以消除ELISA法在檢測HIV抗體中的諸多影響因素，就能保證為每位檢測者提供準(zhǔn)確可靠的檢測結(jié)果。