夾心ELISA實驗方案

簡介

夾心 ELISA 測定兩層抗體（捕獲抗體和檢測抗體）之間的抗原。目標抗原必須包含至少兩個能夠結合到抗體的抗原表位。

單克隆或多克隆抗體均可在夾心 ELISA 系統中用作捕獲抗體和檢測抗體。單克隆抗體識別單一表位，可對抗原中微小差別進行定量檢測。多克隆抗體通常用作捕獲抗體以沉降盡可能多的抗原。

夾心 ELISA 省去了分析之前的樣品純化步驟，而且提高了分析靈敏度（靈敏度比直接或間接 ELISA 高 2-5 倍）。

一般提示

夾心 ELISA 程序可能難以優化，應使用已測試的匹配抗體對。這樣可確保抗體檢測靶蛋白上的不同表位，而不會干擾其它抗體結合。我們不能保證我們的抗體可用于夾心 ELISA，除非它們已經過專門的測試。

用捕獲抗體包被

1.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH 9.6) 中濃度為 1–10 μg/mL 的捕獲抗體包被 PVC 微量滴定板的樣品孔。

如果使用未純化抗體（例如腹水或抗血清），可能需要提高樣品蛋白質的濃度（嘗試 用10 μg/mL）來補償較低濃度的特異性抗體。

2.用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在 4 ℃ 下孵育過夜。

3.棄去包被液，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μL PBS。在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴。

封閉和加樣

1.每孔添加 200 μL 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。

2.用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少 1-2 小時，或在 4 ℃ 下孵育過夜。

3.用 200 µL PBS 洗滌微量滴定板兩次。

4.每孔添加 100 μL 經過稀釋的樣品。通常將未知樣品的信號與標準曲線的信號進行比較。每個板都必須測定標準品（兩重測定或三重測定）和空白樣。在 37 ℃ 下孵育 90 分鐘。

確保標準品的濃度涵蓋抗體結合的大部分動態檢測范圍。可能需要優化濃度范圍以確保獲得合適的標準曲線。樣品和標準品通常采取兩重測定或三重測定。

5.棄去樣品，用 200 μL PBS 洗滌微量滴定板兩次。

用檢測抗體和二抗孵育

1.每孔添加 100 μL 經過稀釋的檢測抗體。

確保檢測抗體識別與捕獲抗體不同的靶蛋白上的表位。這能避免抗體結合受到干擾。盡可能使用已測試的匹配抗體對。

2.用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 2 小時。

3.用 PBS 洗滌微量滴定板四次。

4.添加 100 μL 偶聯二抗，其在使用之前便用封閉緩沖液進行稀釋。

5.用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 1-2 h。

6.用 PBS 洗滌微量滴定板四次。

檢測

辣根過氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (ALP) 是 ELISA 分析中使用*泛的兩種酶。

要考慮到某些生物材料具有高水平的內源酶活性（例如肺泡細胞中的高水平 ALP、紅細胞中的高水平過氧化物酶），這可能會導致非特異性信號。如有必要，用左旋咪唑（針對 ALP）或用 0.3% H2O2 的甲醇溶液（針對過氧化物酶）進行另外的阻斷處理。

ALP 底物

對硝基苯磷酸鹽 (pNPP) 是大多數應用中廣泛使用的底物。在室溫下孵育 15-30 分鐘后，在 405 nm 處測定硝基苯酚呈現的黃色，加入等體積的 0.75 M NaOH 可終止反應。

HRP 顯色液

HRP 的底物為過氧化氫。過氧化氫的裂解與氫供體的氧化偶聯，反應期間氫供體的氧化使顏色發生變化。

TMB（3,3',5,5'-四甲基聯苯胺）

每孔添加 TMB 溶液，孵育 15–30 分鐘，添加等體積的終止液 (2 M H2SO4)，然后在 450 nm 處讀取光密度。

OPD（鄰苯二胺）

在 492 nm 處測定終產物。底物對光敏感，應避光保存。

ABTS（2,2'-聯氮-雙-[3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸]二銨鹽）

終產物為綠色，可在 416 nm 處測定光密度。

某些酶底物被認為是有害的（潛在致癌物），因此始終要小心處理并佩戴手套。

數據分析

利用系列稀釋液數據繪制標準曲線，其中 X 軸（對數標度）為濃度，Y 軸（線性標度）為吸光度。通過內插法在此標準曲線得出樣品濃度。